FRAKSINASI DENGAN KROMATOGRAFI VAKUM CAIR

FRAKSINASI DENGAN KROMATOGRAFI VAKUM CAIR

Dr. Muhtadi, M.Si

Bahan workshop isolasi chemical marker dari bahan alam di UMS 2009

·         Pada prinsipnya adalah kromatografi kolom yang dipercepat proses elusinya dengan bantuan alat vakum (penghisapan)=> waktu lebih cepat, lazimnya hanya 2 – 3 jam saja.

·         Tujuan KVC, untuk fraksinasi senyawa-senyawa dalam suatu ekstrak (menyederhanakan campuran senyawa)

Tahapan pelaksanaan KVC :

1.    Pencarian eluen yang akan digunakan untuk KVC

Prinsipnya :

·         dicari eluen yang memisahkan noda kromatogram dengan Rf mulai  0,1 hingga Rf = 0,5.

·         untuk menghemat pelarut,  biaya lebih murah & menghindari efek toksik yang terjadi, lazimnya digunakan campuran n-heksana:etilasetat.

2.    Penyiapan kolom KVC

Prinsipnya :

·         Berat sampel yang akan dipisahkan akan menentukan pemilihan diameter kolom KVC yang akan digunakan, dengan arahan ketentuan :

Berat sampel (g)	Diameter kolom KKT (cm)	Silika kolom (g)	Perbandingan sampel : silica kvc
15 – 25	14	150 – 250	1 : 10 – 1 : 15
3 – 5	10	60 – 125	1 : 20 – 1 : 25
1 – 2	7	30 – 80	1 : 30 – 1 : 40

·         Tinggi silica dalam kolom KVC lazimnya hanya 5  cm, hingga tinggi maksimal = diameternya (Silica G 60, Katalog Merck : 7730/7731)

·         Packing kolom dilakukan dengan cara : silica dalam kolom KVC dengan dibantu vakum, ditekan-tekan hingga rata, selanjutnya  dihomogenkan dengan eluen (fase gerak) n-heksana.

Catatan : Kolom telah homogen, jika silica tidak ada yang retak & waktu dialiri eluen merata

3.    Penyiapan sampel dengan impregnasi

·         Sampel dilarutkan dalam pelarut yang paling sesuai (larut dengan sempurna). Jika ada sebagian tidak larut, hendaknya sampel yang tidak larut tersebut dipisahkan terlebih dahulu dari larutan dengan penyaringan biasa. Larutan sampel kemudian dicampurkan dengan silika gel impreg (mesh 30 – 70, Katalog : 7733) dengan perbandingan 1:2 antara sampel dengan silica, dan diuapkan pada tekanan rendah menggunakan rotary epaporator sampai kering (bebas pelarut).

·         Sampel yang sudah di-impregnasi dimasukkan ke dalam kolom KVC, dan pada bagian atas sampel diberi kertas saring untuk menghindari penyebaran ekstrak kedalam eluen.

4.    Fraksinasi

Fraksinasi dilakukan dengan menggunakan eluen yang telah terpilih, jumlah fraksi lazimnya hanya 12 – 20 fraksi untuk fraksinasi tahap pertama. Volume eluen untuk setiap kali elusi tergantung dari diameter kolom KVC, dengan arahan sbb. :

Berat sampel (g)	Diameter kolom KKT (cm)	Volume eluen per-elusi (mL)
15 – 25	14	100 – 175
3 – 5	10	75 – 125
1 – 2	7	50 – 75

5.    Pemekatan fraksi dengan cara evaporasi

Pemekatan fraksi dilakukan untuk tujuan agar saat masing-masing fraksi ditotolkan dalam plat KLT, lebih pekat sehingga mempercepat dalam penotolan & noda kromatogram lebih baik.

6.    Analisis KLT hasil fraksinasi

Masing-masing fraksi hasil KKT ditotolkan pada plat KLT, dibandingkan dengan sampel/ekstrak dan standar (chemical marker standar, jika punya). Eluen yang dapat digunakan untuk analisis KLT adalah eluen yang memberikan nilai Rf 0,2 – 0,8 untuk noda-noda kromatogram yang diamati. Fraksi yang memberikan noda kromatogram tunggal dan memiliki Rf sama dengan standar, menunjukkan senyawa murni hasil isolasi yang sama dengan standarnya, selanjutnya digabungkan.

7.    Penggabungan fraksi

Berdasarkan analisis KLT terhadap fraksi-fraksi, maka fraksi yang memiliki noda-noda kromatogram yang mirip dengan nilai Rf yang sama digabungkan, selanjutnya dievaporasi untuk ditentukan beratnya. Fraksi gabungan yang memiliki noda kromatogram lebih sederhana dengan berat yang signifikan dapat dilanjutkan untuk pemurnian. Atau fraksi gabungan yang memiliki noda kromatogram dari chemical marker yang akan diisolasi, dimurnikan lebih lanjut dengan cara KKT atau kromatografi radial atau KLT preparative.