FRAKSINASI DENGAN
KROMATOGRAFI VAKUM CAIR
Dr. Muhtadi, M.Si
Bahan
workshop isolasi chemical marker dari bahan alam di UMS 2009
·
Pada
prinsipnya adalah kromatografi kolom yang dipercepat proses elusinya dengan
bantuan alat vakum (penghisapan)=> waktu lebih cepat, lazimnya hanya 2 – 3
jam saja.
·
Tujuan
KVC, untuk fraksinasi senyawa-senyawa dalam suatu ekstrak (menyederhanakan
campuran senyawa)
Tahapan
pelaksanaan KVC :
1.
Pencarian
eluen yang akan digunakan untuk KVC
Prinsipnya
:
·
dicari
eluen yang memisahkan noda kromatogram dengan Rf mulai 0,1 hingga Rf = 0,5.
·
untuk
menghemat pelarut, biaya lebih murah
& menghindari efek toksik yang terjadi, lazimnya digunakan campuran
n-heksana:etilasetat.
2.
Penyiapan
kolom KVC
Prinsipnya
:
·
Berat
sampel yang akan dipisahkan akan menentukan pemilihan diameter kolom KVC yang
akan digunakan, dengan arahan ketentuan :
|
Berat sampel (g)
|
Diameter kolom KKT (cm)
|
Silika kolom (g)
|
Perbandingan sampel : silica kvc
|
|
15 – 25
|
14
|
150 – 250
|
1 : 10 – 1 : 15
|
|
3 – 5
|
10
|
60 – 125
|
1 : 20 – 1 : 25
|
|
1 – 2
|
7
|
30 – 80
|
1 : 30 – 1 : 40
|
·
Tinggi
silica dalam kolom KVC lazimnya hanya 5
cm, hingga tinggi maksimal = diameternya (Silica G 60, Katalog Merck :
7730/7731)
·
Packing
kolom dilakukan dengan cara : silica dalam kolom KVC dengan dibantu vakum,
ditekan-tekan hingga rata, selanjutnya dihomogenkan dengan eluen (fase gerak) n-heksana.
Catatan : Kolom telah homogen, jika
silica tidak ada yang retak & waktu dialiri eluen merata
3.
Penyiapan
sampel dengan impregnasi
·
Sampel dilarutkan dalam pelarut yang paling sesuai (larut dengan
sempurna). Jika ada sebagian tidak larut, hendaknya sampel yang tidak larut
tersebut dipisahkan terlebih dahulu dari larutan dengan penyaringan biasa.
Larutan sampel kemudian dicampurkan dengan silika gel impreg (mesh 30 – 70, Katalog :
7733) dengan perbandingan 1:2 antara sampel dengan
silica, dan diuapkan pada tekanan rendah menggunakan rotary epaporator sampai
kering (bebas pelarut).
·
Sampel yang sudah di-impregnasi dimasukkan ke dalam kolom KVC, dan
pada bagian atas sampel diberi kertas saring untuk menghindari penyebaran
ekstrak kedalam eluen.
4.
Fraksinasi
Fraksinasi
dilakukan dengan menggunakan eluen yang telah terpilih, jumlah fraksi lazimnya
hanya 12 – 20 fraksi untuk fraksinasi tahap pertama. Volume eluen untuk setiap
kali elusi tergantung dari diameter kolom KVC, dengan arahan sbb. :
|
Berat sampel (g)
|
Diameter kolom KKT (cm)
|
Volume
eluen per-elusi (mL)
|
|
15 – 25
|
14
|
100 – 175
|
|
3 – 5
|
10
|
75 – 125
|
|
1 – 2
|
7
|
50 – 75
|
5.
Pemekatan
fraksi dengan cara evaporasi
Pemekatan fraksi dilakukan untuk tujuan agar saat
masing-masing fraksi ditotolkan dalam plat KLT, lebih pekat sehingga
mempercepat dalam penotolan & noda kromatogram lebih baik.
6.
Analisis
KLT hasil fraksinasi
Masing-masing fraksi hasil KKT ditotolkan pada plat KLT,
dibandingkan dengan sampel/ekstrak dan standar (chemical marker standar, jika punya). Eluen yang dapat digunakan
untuk analisis KLT adalah eluen yang memberikan nilai Rf 0,2 – 0,8 untuk
noda-noda kromatogram yang diamati. Fraksi yang memberikan noda kromatogram
tunggal dan memiliki Rf sama dengan standar, menunjukkan senyawa murni hasil isolasi
yang sama dengan standarnya, selanjutnya digabungkan.
7.
Penggabungan
fraksi
Berdasarkan
analisis KLT terhadap fraksi-fraksi, maka fraksi yang memiliki noda-noda
kromatogram yang mirip dengan nilai Rf yang sama digabungkan, selanjutnya
dievaporasi untuk ditentukan beratnya. Fraksi gabungan yang memiliki noda
kromatogram lebih sederhana dengan berat yang signifikan dapat dilanjutkan
untuk pemurnian. Atau fraksi gabungan yang memiliki noda kromatogram dari
chemical marker yang akan diisolasi, dimurnikan lebih lanjut dengan cara KKT
atau kromatografi radial atau KLT preparative.
