Total Protein Determination By the Lowry Method

Authors: Paul Held Ph. D., Senior Scientist, Applications Dept., BioTek Instruments, Inc.; Janet Hurley Dept. of Molecular Physiology and Biophysics University of Vermont School of Medicine

It's Fast, It's Easy, and It Turns Blue

Quantitation of total protein content of samples is a measurement common to many applications in basic science and clinical research. Here we describe the use of BioTek Instruments ELx808 microplate reader to perform the Lowry method for total protein determination.

Introduction

Quantitation of total protein content is a measurement common to many applications in basic science research and routine clinical laboratory practice. Most biochemical studies that involve the measurement of a biological activity require the normalization of that activity to the protein content. The specific activity of a particular enzymatic activity is of particular importance when proteins are being purified or different samples are being compared. The most utilized methods to assay total protein rely on the reduction of copper in the presence of a chromogenic reagent (1, 2). Regardless of the method of protein determination, laboratories requiring high throughput have often adapted the described protocol to a 96-well format.

Materials and Methods

The assay performed in microplates is essentially a micro Lowry assay (1) that has been adapted to microplates. The reagents can be purchased in a kit (Catalogue No. 690-A: Sigma Chemical, St. Louis MO) or obtained as individual components from the same vendor.

A standard curve was prepared as follows. Bovine serum albumin (BSA) powder was dissolved in distilled water and diluted to a concentration of 1 µg/ml. A series of dilutions (0, 1, 2.5, 5, 10, and 20 µg/well) were made in replicates of 4 with a final volume of 100 µl. Samples were diluted such that they would fall within the BSA standard range (0-25 µg / 100 µl) and 100 µl placed in each well. After standards and samples were diluted and transferred to the microplate, 200 ul of biuret reagent was added to each well and mixed thoroughly with repeated pipeting. Biuret reagent was prepared by mixing 0.5 ml of 1% cupric sulfate with 0.5 ml of 2% sodium potassium tartrate, followed by the addition of 50 ml of 2% sodium carbonate in 0.1 N NaOH. The mixture was then allowed to incubate at room temperature for 10-15 minutes prior to the addition of 20 µl per well of 1.0 N Folin & Ciocalteu's reagent. Samples were mixed immediately with repeated pipeting with each addition. Color was allowed to develop for 30 minutes at room temperature and the absorbance measured at 650 nm and blanked on the water only control. Although in these experiments the plates were read immediately, the reaction was found to be stable for up to an hour.

All absorbance determinations were made using an ELx808 Microplate Reader (BioTek Instruments, Winooski, VT) with the reader controlled by an external PC running KC3 data reduction software (BioTek Instruments, Winooski, VT). Regression analysis and statistics of the curve were performed using KC3.

Results

The absorbance of the Lowry reaction was determined for BSA protein concentrations ranging from 0.0 to 20 µg per well. Over this range the absorbance increased in a hyperbolic fashion. Using KC3 data reduction software (BioTek Instruments), a polynomial non linear equation describing the standard curve can be generated .

Figure 1. Linearity of the assay. Concentration curve from 0 to 20 µg/well of BSA with polynomial regression analysis. Image depicts the screen output from KC3 of a typical standard curve of a Lowry protein assay. Note that the equation describing the regression curve is provided along with statistics concerning the curve.

Although the curve begins to plateau at a protein concentrations of 10 µg/well, determinations can be made with a high level of confidence (r² = 0.99). Determinations in the lower portion of the curve offer the greatest degree of accuracy with a polynomial fit due to the greater change in signal verses change in protein concentration. As demonstrated in Figure 2, if only low concentrations of protein are assayed (i.e. below 10 µg/well) then a calibration curve determined using linear regression analysis rather than a polynomial analysis can be used with confidence (r² = 0.99). Routine dilution of each sample would be expected to provide determinations at an appropriate concentration.

The flattening of the absorbance curve observed above the 10 µg level and subsequent loss of the linear increase in absorbance for higher protein concentrations is most likely the result of reagents no longer being in total excess in relation to the oxidizable amino acids necessary for the colorimetric reaction to take place. With high protein levels, reacted chromogenic material was found to precipitate out of solution.

 Calibration curve. Concentration curve from 0 to 10 mg/well of BSA with linear regression analysis. Using the data depicted in Figure 1 a linear regression analysis was performed using the 0-10 µg/well standards. Image depicts the screen output from KC3 of a typical standard curve of a Lowry protein assay. Note that the equation describing the regression curve is provided along with statistics concerning the curve.

Discussion

The ability to easily and reliably quantitate total protein content in samples is paramount to many biological assays. Although the Lowry protein assay was first published in 1951, several improvements, not the least of which is the reduction in assay volume, have increased sensitivity of the assay. Recently fluorescent protein assays have been developed with improved sensitivity (3), but the cost per assay can make them unacceptable for large numbers of samples.

Although the Lowry total protein assay has withstood the test of time, there are several features of the assay that have to be kept in mind. Because these methods rely on the presence of readily oxidizable amino acids such as tyrosine, cysteine, and tryptophan there is a variation in response from proteins with differing amino acid content. Therefore it is advisable that the protein used for generating the standard curve be consistent from experiment to experiment. Likewise, an overabundance of the amino acids in relation to the assay reagents, as would occur with high protein level, will result in a loss of linearity of the assay. In extreme cases this will lead to a precipitation of the chromogens and loss of color prematurely. Likewise, the assay color is only stable for approximately one hour, after which a similar phenomenon occurs in samples with normal concentrations.

The use of KC3 software to control the reader allows the user a great deal of flexibility in regards to data reduction capabilities. The software allows the user to define any configuration of plate map necessary. With several different curve fit algorithms to choose from, regression analysis of the standards and the subsequent concentration determinations of samples can be accomplished with a high degree of confidence. Likewise, the software is capable of performing statistical analysis on sample groups, as well as any mathematical calculation required by the user.

Like most assays that are read in microplates, the ability to read all of the samples simultaneously greatly reduces the manual labor required to obtain the data. The microplate format also lends itself to 'off the shelf' automation for laboratories with high volume requirements. The smaller reaction volumes in microplates will lead to lower per assay costs by reducing the amount of expensive reagents necessary to perform the assay.

References

1. Lowry, O.H., N.J. Rosebrough, A.L. Farr, and R.J. Randall (1951) Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275

2. Smith, P.K., et al. (1985) Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid. Anal. Biochem. 150:76-85.

3. NanoOrange Protein Quantitation Kit Instructions Molecular Probes, Inc. Eugene Oregon

Birrul walidain

Cara berbakti kepada Ibu dan Bapak

Oleh : Asy Syaikh Muhammad bin Jamil Zainu

1. Berbicaralah kamu kepada kedua orang tuamu dengan adab dan janganlah mengucapkan “Ah” kepada mereka, jangan hardik mereka, berucaplah kepada mereka dengan ucapan yang mulia.

2. Selalu taati mereka berdua di dalam perkara selain maksiat, dan tidak ada ketaatan kepada makhluk di dalam bermaksiat kepada sang Khalik.

3. Lemah lembutlah kepada kedua orangtuamu, janganlah bermuka masam serta memandang mereka dengan pandangan yang sinis.

4. Jagalah nama baik, kemuliaan, serta harta mereka. Janganlah engkau mengambil sesuatu tanpa seizin mereka.

5. Kerjakanlah perkara-perkara yang dapat meringankan beban mereka meskipun tanpa diperintah. Seperti melayani mereka, belanja ke warung, dan pekerjaan rumah lainnya, serta bersungguh-sungguhlah dalam menuntut ilmu.

6. Bermusyawarahlah dengan mereka berdua dalam seluruh kegiatanmu. Dan berikanlah alasan jika engkau terpaksa menyelisihi pendapat mereka.

7. Penuhi panggilan mereka dengan segera dan disertai wajah yang berseri dan menjawab, “Ya ibu, ya ayah”. Janganlah memanggil dengan, “Ya papa, ya mama”, karena itu panggilan orang asing (orang-orang barat maksudnya –pent.).

8. Muliakan teman serta kerabat mereka ketika kedua orang tuamu masih hidup, begitu pula setelah mereka telah wafat.

9. Janganlah engkau bantah dan engkau salahkan mereka berdua. Santun dan beradablah ketika menjelaskan yang benar kepada mereka.

10. Janganlah berbuat kasar kepada mereka berdua, jangan pula engkau angkat suaramu kepada mereka. Diamlah ketika mereka sedang berbicara, beradablah ketika bersama mereka. Janganlah engkau berteriak kepada salah seorang saudaramu sebagai bentuk penghormatan kepada mereka berdua.

11. Bersegeralah menemui keduanya jika mereka mengunjungimu, dan ciumlah kepala mereka.

12. Bantulah ibumu di rumah. Dan jangan pula engkau menunda membantu pekerjaan ibumu.

13. Janganlah engkau pergi jika mereka berdua tidak mengizinkan meskipun itu untuk perkara yang penting. Apabila kondisinya darurat maka berikanlah alasan ini kepada mereka dan janganlah putus komunikasi dengan mereka.

14. Janganlah masuk menemui mereka tanpa izin terlebih dahulu, apalagi di waktu tidur dan istirahat mereka.

15. Jika engkau kecanduan merokok, maka janganlah merokok di hadapan mereka.

16. Jangan makan dulu sebelum mereka makan, muliakanlah mereka dalam (menyajikan) makanan dan minuman.

17. Janganlah engkau berdusta kepada mereka dan jangan mencela mereka jika mereka mengerjakan perbuatan yang tidak engkau sukai.

18. Jangan engkau utamakan istri dan anakmu di atas mereka. Mintalah keridhaan mereka berdua sebelum melakukan sesuatu karena ridha Allah tergantung ridha orang tua. Begitu juga kemurkaan Allah tergantung kemurkaan mereka berdua.

19. Jangan engkau duduk di tempat yang lebih tinggi dari mereka. Jangan engkau julurkan kakimu di hadapan mereka karena sombong.

20. Jangan engkau menyombongkan kedudukanmu di hadapan bapakmu meskipun engkau seorang pejabat besar. Hati-hati, jangan sampai engkau mengingkari kebaikan-kebaikan mereka berdua atau menyakiti mereka walaupun dengan hanya satu kalimat.

21. Jangan pelit dalam memberikan nafkah kepada kedua orang tua sampai mereka mengeluh. Ini merupakan aib bagimu. Engkau juga akan melihat ini terjadi pada anakmu. Sebagaimana engkau memperlakukan orang tuamu, begitu pula engkau akan diperlakukan sebagai orang tua.

22. Banyaklah berkunjung kepada kedua orang tua, dan persembahkan hadiah bagi mereka. Berterimakasihlah atas perawatan mereka serta atas kesulitan yang mereka hadapi. Hendaknya engkau mengambil pelajaran dari kesulitanmu serta deritamu ketika mendidik anak-anakmu.

23. Orang yang paling berhak untuk dimuliakan adalah ibumu, kemudian bapakmu. Dan ketahuilah bahwa surga itu di telapak kaki ibu-ibu kalian.

24. Berhati-hati dari durhaka kepada kedua orang tua serta dari kemurkaan mereka. Engkau akan celaka dunia akhirat. Anak-anakmu nanti akan memperlakukanmu sama seperti engkau memperlakukan kedua orangtuamu.

25. Jika engkau meminta sesuatu kepada kedua orang tuamu, mintalah dengan lembut dan berterima kasihlah jika mereka memberikannya. Dan maafkanlah mereka jika mereka tidak memberimu. Janganlah banyak meminta kepada mereka karena hal itu akan memberatkan mereka berdua.

26. Jika engkau mampu mencukupi rezeki mereka maka cukupilah, dan bahagiakanlah kedua orangtuamu.

27. Sesungguhnya orang tuamu punya hak atas dirimu. Begitu pula pasanganmu (suami/istri) memiliki hak atas dirimu. Maka penuhilah haknya masing-masing. Berusahalah untuk menyatukan hak tersebut apabila saling berbenturan. Berikanlah hadiah bagi tiap-tiap pihak secara diam-diam.

28. Jika kedua orang tuamu bermusuhan dengan istrimu maka jadilah engkau sebagai penengah. Dan pahamkan kepada istrimu bahwa engkau berada di pihaknya jika dia benar, namun engkau terpaksa melakukannya karena menginginkan ridha kedua orang tuamu.

29. Jika engkau berselisih dengan kedua orang tuamu di dalam masalah pernikahan atau perceraian, maka hendaknya kalian berhukum kepada syari’at karena syari’atlah sebaik-baiknya pertolongan bagi kalian.

30. Doa kedua orang itu mustajab baik dalam kebaikan maupun doa kejelekan. Maka berhati-hatilah dari doa kejelekan mereka atas dirimu.

31. Beradablah yang baik kepada orang-orang. Siapa yang mencela orang lain maka orang tersebut akan kembali mencelanya. Rasulullah shallallahu ‘alaihi wasallam bersabda, “Termasuk dosa besar adalah seseorang mencela kedua orang tuanya dengan cara dia mencela bapaknya orang lain, maka orang tersebut balas mencela bapaknya. Dia mencela ibu seseorang, maka orang tersebut balas mencela ibunya.” (Muttafaqun ‘alaihi).

32. Kunjungilah mereka disaat mereka hidup dan ziarahilah ketika mereka telah wafat. Bershadaqahlah atas nama mereka dan banyaklah berdoa bagi mereka berdua dengan mengucapkan, “Wahai Rabb-ku ampunilah aku dan kedua orang tuaku. Waha Rabb-ku, rahmatilah mereka berdua sebagaimana mereka telah merawatku ketika kecil”. (*)

Percobaan Reaksi Dehidrasi Alkohol di Laboratorium Kimia Farmasi UII

Reaksi Dehidrasi Alkohol

Tujuan Percobaan:

Pada percobaan kali ini bertujuan agar mahasiswa dapat menggunakan teori reaksi dehidrasi alkohol dalam pembuatan sikloheksena.

Pendahuluan:

Dehidrasi alkohol merupakan rute sintesis yang bermanfaat pada alkena. Alkohol pada umumnya menjalani reaksi eliminasi jika dipanaskan dengan katalis asam kuat, misal H₂SO₄ atau asam fosfat (H₃PO₄) untuk menghasilkan alkena dan air. Gugus hidroksil bukan merupakan leaving group (gugus pergi) yang baik, akan tetapi di bawah kondisi asam, gugus hidroksil dapat diprotonasi. Ionisasi akan menghasilkan suatu molekul air dan kation, yang selanjutnya dapat mengalami deprotonasi untuk memberikan alkena.

Dehidrasi alkohol 2° dan alkohol 3° adalah reaksi E1 (eliminasi 1) yang melibatkan pembentukan karbokation, sedangkan dehidrasi alkohol 1° adalah reaksi E2 (eliminasi 2). Suatu reaksi E2 terjadi pada satu tahap, yaitu tahap pertama asam akan memprotonasi oksigen dari alkohol, proton diambil oleh basa (H₂SO₄^-) dan secara simultan membentuk ikatan rangkap karbon-karbon (C=C) melalui hilangnya molekul air.

                     

Alat dan Bahan:

-          Sikloheksanol	-          Labu alas bulat 50 ml
-          Asam sulfat pekat	-          Bekerglass 25 ml
-          Asam fosfat	-          Icebath
-          Batu didih	-          1 set alat destilasi
-          Natrium karbonat	-          Corong pisah
-          Kalsium klorida anhidrat	-          Pipet tetes
-          Aseton

Cara Kerja:

1.       Rakitlah alat-alat destilasi, gunakan labu 50 ml untuk yang dipanasi, dan bekerglass 25 ml untuk menampung destilat. Cek kembali rangkaian alat destilasi telah terpasang dengan baik. Gunakan icebath untuk menempatkan labu penampung destilat.

2.       Masukkan 8-10 g sikloheksanol ke dalam labu 50 ml, tambahkan 2 ml asam sulfat pekat dan 2 ml asam fosfat. Campurkan hingga homogen.

3.      Masukkan batu didih, dan panaskan labu secara hati-hati hingga campuran bahan mulai terdestilasi. Lanjutkan dengan menampung destilat jika temperatur telah mencapai 85-90°C.

4.      Setelah proses destilasi selesai, pindahkan destilat ke corong pisah, akan terbentuk 2 lapis, yaitu alkena dan air sebagai produk dari reaksi.

5.      Tambahkan 5 ml natrium karbonat 5%. Campurkan dengan baik, pisahkan lapisan air dengan menggunakan pipet. Ulangi pencucian dengan natrium karbonat 5%, pisahkan produk dengan lapisan air.

6.       Ke dalam bekerglass tambahkan kalsium klorida anhidrat secukupnya untuk menghilangkan air yang masih tertahan. Biarkan 5-10 menit. Jika agen pengering mulai mencair, tambahkan kembali secukupnya.

7.      Sementara itu bersihkan alat destilasi dengan menggunakan aseton mulai dari atas labu, dan biarkan hingga kering. Untuk melakukan destilasi ulang, paling tidak produk kotor yang telah dihasilkan adalah 5 ml.

8.      Rakit kembali alat destilasi, gunakan labu 25 ml yang bersih sebagai labu untuk dipanaskan, masukkan batu didih. Gunakan labu Erlenmeyer untuk menampung destilat, tanpa menggunakan icebath.

9.      Mulai lakukan destilasi, dan jaga temperatur di bawah 85°C. Pindahkan produk akhir dalam labu yang bersih.

10.   Hitung percent yield!